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HES-KI（重要基因位点敲入）技术平台
独特筛选机制保证了高效率基因敲入
基因敲入（Knock-in, KI）技术在细胞治疗和工业生产领域具有巨大潜力，但传统敲入方法效率低下，限制了基因敲入在这些领域的应用。当前的敲入技术依赖于同源定向修复（HDR），但细胞更倾向于顺利获得非同源末端连接（NHEJ）修复DNA双链断裂，导致敲入效率低。现有的CRISPR/HDR与AAV（腺相关病毒）Donor介导的基因敲入是使用较频繁和高效的方法，但AAV存在基因组频繁串联敲入风险，以及存在成本高、制造复杂和载荷限制等问题，也限制了基因敲入的应用。因此，开发高效、精准、稳定的基因敲入平台尤为重要。
HES-KI（重要基因位点敲入）是一种新型的敲入技术，顺利获得在重要基因的C端外显子区域进行CRISPR编辑，并设计一个转基因敲入模板，使得成功敲入的细胞能够恢复重要基因的功能，同时整合敲入的基因序列；如果未成功敲入细胞，如NHEJ介导的有插入或缺失（indels）的细胞，将导致重要基因功能丧失，使细胞无法存活，从而实现对成功敲入细胞的富集。
设计原理
技术优势
•高效率： 顺利获得重要基因筛选机制，提高敲入效率，避免非特异性敲入，在多种细胞类型中实现高达68%的敲入效率，远超传统技术。
•表达稳定且均一： 成功敲入单克隆细胞中目的基因表达稳定性和均一性高。
•多基因整合： 可同时敲入多个基因，例如，敲入多个CAR基因，全面靶向多种肿瘤抗原，减少肿瘤逃逸。
•调控能力强： 顺利获得选择不同的必需基因，可灵活调整目的基因表达水平；可根据实验需求选择AAV或质粒Donor。
•表达稳定且均一： 成功敲入单克隆细胞中目的基因表达稳定性和均一性高。
•多基因整合： 可同时敲入多个基因，例如，敲入多个CAR基因，全面靶向多种肿瘤抗原，减少肿瘤逃逸。
•调控能力强： 顺利获得选择不同的必需基因，可灵活调整目的基因表达水平；可根据实验需求选择AAV或质粒Donor。
技术流程
HES-KI系统选择
可根据实验需求选择不同表达水平的重要基因为敲入靶点；根据细胞转染难易程度选择不同的CRISPR系统和Donor的递送方式。
| 重要基因 | CRISPR系统 | CRISPR递送方法 | Donor形式 |
|---|---|---|---|
| GAPDH TUBB KIF11 TBP ...... |
Cas9-sgRNA | 质粒 | 质粒 |
| AsCas12a-crRNA | RNP | AAV |
应用案例
案例一 AsCas12介导的HES-KI
目的：K562细胞GAPDH基因C端插入EGFP
设计：
结果：
•使用HES-KI技术在K562细胞GAPDH中敲入EGFP，未使用抗性筛选情况下多克隆的敲入效率达到37%
•K562 EGFP-KI细胞和WT细胞单克隆细胞株倍增时间差异不显著，EGFP插入后不影响K562细胞生长。
目的：K562细胞GAPDH基因C端插入EGFP
设计：
结果：
•使用HES-KI技术在K562细胞GAPDH中敲入EGFP，未使用抗性筛选情况下多克隆的敲入效率达到37%
•K562 EGFP-KI细胞和WT细胞单克隆细胞株倍增时间差异不显著，EGFP插入后不影响K562细胞生长。
•不同K562 EGFP-KI单克隆细胞株EGFP mRNA表达量差异不显著，EGFP-KI单克隆均一性好。
•K562 EGFP-KI单克隆细胞株经过15代陆续在传代培养，EGFP mRNA表达量稳定。
•K562 EGFP-KI细胞图片
| K562 EGFP-KI 多克隆 | |
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| K562 EGFP-KI 单克隆 | |
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案例二 Cas9介导的HES-KI
目的：293T和CHO-K1细胞GAPDH基因C端插入EGFP
设计：
结果：
•使用HES-KI技术，293T多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到68%。在CHO-K1多克隆细胞中，EGFP的敲入效率达到55%。目的：293T和CHO-K1细胞GAPDH基因C端插入EGFP
设计：
结果：
•293T和CHO-K1 EGFP-KI多克隆细胞图片
| 293T | CHO-K1 |
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案例三 HES-KI介导IPSC多基因敲入
目的：IPSC细胞基于AsCas12a介导的HES-KI技术在GAPDH基因C端成功敲入GFP和mCherry基因。
设计：
结果：
IPSC细胞成功同时敲入GFP基因和mCherry基因，荧光表达亮度高，均一性较好。目的：IPSC细胞基于AsCas12a介导的HES-KI技术在GAPDH基因C端成功敲入GFP和mCherry基因。
设计：
结果：
案例四 HES-KI介导大片段敲入
目的：IPSC细胞基于AsCas12a介导的HES-KI技术在GAPDH基因C端成功敲入5.2 kb大片段基因。
设计：
结果：
IPSC细胞敲入5.2 kb大片段基因序列，顺利获得流式细胞仪检测，GFP基因和mCherry敲入比例高达98.1%，成功表达大片段基因。目的：IPSC细胞基于AsCas12a介导的HES-KI技术在GAPDH基因C端成功敲入5.2 kb大片段基因。
设计：
结果：
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